A Maquinaria da Replicação do DNA - Professor Lyndon Johnson*

A forquilha de replicação do DNA com suas fitas antiparalelas

A ELEGÂNCIA DA MOLÉCULA

Quando Watson e Crick em 1953 revelaram ao mundo a estrutura da molécula de DNA, a característica que mais chamou a atenção foi a relação de complementaridade entre as bases nitrogenadas que integravam as duas cadeias. Foi justamente essa elegância complementar que convenceu muitos pesquisadores a aceitarem a conclusão de Oswald T. Avery de que o DNA, e não alguma forma de proteína, era o responsável pela informação genética. Com o famoso experimento de Meselson e Stahl (isótopos ¹⁵N e ¹⁴N) ficou comprovado que o DNA sozinho poderia atuar como molde para a síntese de novas fitas de DNA através de uma replicação semiconservativa, ou seja, cada uma das duas fitas da molécula de DNA parental serviria como um molde para a formação de uma fita filha complementar. O DNA é uma longa molécula que integra os cromossomos e que necessita de sítios de origem para abrir as forquilhas de replicação. Velocidade, precisão e perfeição, são as exigências de uma sincronizada replicação que para isso conta com um kit de proteínas especiais e o RNA.

OS INGREDIENTES NECESSÁRIOS

         Para que uma molécula de DNA possa de replicar se faz necessário os seguintes ingredientes:

    a) DNA Parental: Atua como molde de orientação para a síntese das novas fitas. 
 b)Desoxirribonucleotídeos Trifosfatados: dGTP, dCTP, dATP e dTTP são os quatro desoxirribonucleotídeos trifosfatados, precursores ricos em energia que integram os blocos que compõe o DNA.  

    c) Ponto de Origem (Replicons): É um sítio específico onde o DNA é desenrolado e a replicação tem início. Como em procariontes só existe uma origem para a replicação, o cromossomo inteiro é um único replicon. Em eucariontes são várias origens para a replicação e por isso cada cromossomo possui vários replicons levando a abertura de várias “bolhas de replicação”. O replicon possui dois componentes básicos: um replicador (sequencia específica linear de nucleotídeos do DNA) e uma proteína iniciadora (liga-se à sequência específica do DNA no replicador promovendo a abertura inicial do DNA), logo em seguida, o replicador recruta a DNA-Helicase para dar continuidade ao processo da replicação.

   d) Primer (Iniciador): Trata-se de um pequeno segmento de RNA complementar ao molde a fim de expor o grupo 3’-OH para que os novos nucleotídeos possam ser adicionados por meio da ligação fosfodiéster.

   e) Energia: É fundamental em dois momentos: (1) Durante a abertura da forquilha de replicação pela enzima DNA-helicase, fato que necessita da hidrólise de ATP; (2) Para a realização da ligação fosfodiéster e a incorporação de novos nucleotídeos, fato que necessita da hidrólise do pirofosfato pela enzima pirofosfatase fornecendo energia livre para que uma nova ligação possa ocorrer ou da hidrólise do ATP por parte da DNA-ligase nos pontos de soldadura.

   f) Proteínas Acessórias: Dão suporte ao sucesso da replicação, são elas: proteínas grampos deslizantes (aumentam a eficiência da replicação) e as proteínas SSB (evitam com que as fitas que já estão separadas na forquilha de replicação voltem a se emparelharem). 

    g) Enzimas: Existem várias enzimas que atuam na replicação do DNA, vamos a elas: 

I – DNA-Helicase

Enzima que catalisa a separação das duas fitas do dúplex de DNA por meio da hidrólise de ATP. Tal enzima é uma proteína hexamérica em forma de “anel” que circunda uma das fitas do DNA e avança rompendo as pontes de hidrogênio. Independentemente de qual fita a DNA-Helicase esteja acoplada ela sempre se desloca em uma direção definida (polaridade). 

Topoisomerase removendo supertorção

II – Topoisomerase

É a enzima que alivia a supertorção do DNA à medida que a helicase avança. Quando o DNA vai abrindo a forquilha de replicação, o trecho a sua frente que ainda está fechado, fica supercontorcido. Para amenizar essa tensão, a enzima topoisomerase quebra e restaura uma das fitas à frente, a cada 10 pares de bases que foram abertos atrás, com isso, a supertorção é reduzida na forquilha de replicação.

III – Primase

É uma RNA-polimerase especializada em sintetizar pequenos trechos iniciadores de RNA (primer) sobre um molde de DNA. Em eucariontes essa enzima é acoplada a uma Pol α formando um complexo proteico chamado Pol α/primase. O primer deixa exposto uma extremidade 3’-OH livre para que a DNA-polimerase possa catalisar a replicação. Enquanto a fitar líder (contínua) necessita apenas de um primer, a fita tardia (descontínua) requer um novo primer para cada Fragmento de Okasaki adicionado.

IV – RNAse-H

Por meio de um mecanismo de reparo a enzima RNAse reconhece no duplex os trechos híbridos de DNA/RNA (por isso o “H” do nome) e remove os primers que estavam acoplados no duplex, exceto o último ribonucleotídeo diretamente ligado à extremidade do DNA. Isso ocorre porque a RNAse pode apenas clivar a ligação entre dois ribonucleotídeos. O ribonucleotídeo final é removido por uma exonuclease que degrada RNA ou DNA a partir de sua extremidade 5’. As lacunas deixadas no DNA após a ação da RNAse são preenchidas pela DNA-poli através do pareamento de cada nucleotídeo, deixando uma molécula de DNA quase completa (ainda resta soldar a extremidade 3’-OH com a 5’-fosfato da fita reparada).

V – DNA-ligase

Por meio da hidrólise do ATP essa enzima forma uma ligação fosfodiéster entre 5’-fosfato e uma 3’-OH adjacentes.
VI – DNA-Polimerases
            Em procariontes existem cinco tipos diferentes de DNA-Polimerase:

Tipos de DNA-Polimerases	Função
Pol I	Remoção de primer
Pol II	Reparo do DNA
Pol III	Replicação cromossômica
Pol IV	Reparo e síntese transleção (TLS)
Pol V	Síntese transleção (TLS)*

* Síntese Transleção (TLS) é um mecanismo que permite a maquinaria de replicação desviar dos trechos que contenham lesões. 

RNAse removendo primers

       As células eucarióticas também possuem múltiplas DNA-Polimerases (pelo menos 15!) onde a maioria está envolvida no reparo do DNA. Destas, três são essenciais na duplicação do genoma: Pol α/primase (realiza a síntese de um primer dando início a uma nova fita), Pol δ (realiza a replicação do DNA e o reparo por excisão de bases) e a Pol ε (realiza a replicação do DNA e o reparo por excisão de nucleotídeos).
         Ao contrário da maioria das enzimas que possuem um sítio ativo dedicado a uma única reação, a DNA-Polimerase utiliza um único sítio ativo para catalisar a adição de qualquer um dos quatro nucleotídeos trifosfatados (isso porque a geometria dos pares de bases A:T e C:G são praticamente idênticas). Outra grande versatilidade dessas enzimas é a capacidade impressionante para distinguir entre ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos. Na DNA-Polimerase, o sulco de ligação ao nucleotídeo é muito pequeno para permitir a presença de uma 2’-OH do nucleotídeo que será incorporado.                  
       As DNA-Polimerases são altamente processivas, fato que torna a catálise da replicação algo muito rápido. O grau de processividade é definido como o número médio de nucleotídeos adicionados cada vez que a enzima se liga à junção iniciador na fita molde. Fala-se em 50.000 bases adicionadas por evento de ligação. A justificativa para tal eficiência está na associação que a DNA- Pol δ faz com as proteínas em forma de argola chamadas de grampos deslizantes. Esses grampos, que são adicionados enzimaticamente, mantêm a Pol δ sempre próxima do DNA evitando assim com que ela se afaste durante a replicação.  

A verdadeira mão de Deus que possibilita a vida 

      As DNA-Polimerases se assemelham a uma mão (com palma, polegar e dedos) que segura a junção iniciador-molde. O domínio da palma é composto por uma estrutura em folha β e contém dois íons metálicos (Mg⁺² ou Zn⁺²), um deles arranca o “H” do grupo 3’-OH existente, criando 3’-O^‑ nucleofílico que irá atacar o α-fosfato, o outro interage temporariamente com os três fosfatos do  nucleotídeo que está sendo incorporado neutralizando suas cargas negativas. Tais alterações químicas são indispensáveis para a ocorrência da ligação fosfodiéster. Durante a incorporação de um novo nucleotídeo, primeiro ocorre o pareamento correto entre os pares de bases e somente depois a ligação fosfodiéster acontece. Após o pareamento correto de bases, o domínio dos dedos sofre uma torção fechando a mão da polimerase, aproximando com isso o novo nucleotídeo que está sendo adicionado aos íons metálicos. O domínio do polegar serve para manter a posição correta entre o iniciador e o sítio ativo, bem como também para fixar a enzima a seu substrato.  

A estrutura de um grampo deslizante de DNA

           Além de catalisar a polimerização do DNA, uma outra versatilidade das DNA-polimerases é de poderem atuar no mecanismo de reparo, removendo os nucleotídeos que estão incorretamente pareados e com isso mantendo as taxas de mutações relativamente baixas. As que clivam o DNA a partir da extremidade 3’ são chamadas genericamente de exonucleases e as que clivam no meio da fita do DNA são ditas endonucleases.

A DNA-polimerase "prende" o molde e o nucleotídeo que será incorporado quando um par correto é formado

                                                 A FORQUILHA DE REPLICAÇÃO

            A junção entre as duas fitas molde recém-separadas e o dúplex de DNA não replicado é conhecida como forquilha de replicação. A natureza antiparalela do DNA faz com que uma das fitas seja replicada de forma contínua à medida que a forquilha de replicação se movimenta (fita líder ou leading strand). A outra fita de sentido oposto (fita tardia ou lagging strand) é replicada de forma descontínua, por meio de trechos que variam de 1000 a 2000 nucleotídeos de comprimento nas bactérias, e de 100 a 400 nucleotídeos nos eucariontes. Tais trechos são chamados de fragmentos de Okasaki.

          A combinação de todas as proteínas que atuam na forquilha de replicação é denominada replissomo. Juntas, essas proteínas formam uma maquinaria precisamente ajustada à síntese de DNA que contém várias máquinas interagindo entre si. Individualmente, essas máquinas desempenham funções específicas importantes. Quando combinadas, suas atividades são coordenadas pelas interações entre elas. Um bom exemplo é revelado quando a DNA-Polimerase interage com a DNA-Helicase que por sua vez recruta a primase para a origem da replicação.

           Para evitar a rápida reiniciação de uma nova replicação (em cada ciclo de divisão celular existe apenas um ciclo de iniciação da replicação) um mecanismo de alteração no estado de metilação do DNA antes e depois da replicação é acionado. Antes da replicação ambas as fitas do DNA estão metiladas favorecendo a incorporação da proteína iniciadora, porém, com a abertura da bolha de replicação ocorre a conversão para um estado hemimetilado (apenas uma das duas fitas fica metilada) e com isso a proteína iniciadora é impedida temporariamente de reiniciar a replicação a partir das duas cópias de origem recém-sintetizadas.

             Agora imagine que uma base nitrogenada do DNA de uma bactéria fosse do tamanho de um livro, nessa escala, o DNA de fita dupla teria um metro de diâmetro e o genoma completo desse procarionte daria um círculo de 800 km de circunferência. O replissomo (complexo enzimático da replicação) seria do tamanho de uma caminhonete Frontier-Nissan e estando se deslocando a mais de 600 km por hora! A replicação do genoma inteiro levaria 40 minutos, uma viagem de 400 km para as duas caminhonetes, cada uma formando um rastro com dois cabos de DNA de 1 metro de diâmetro atrás de si. O mais impressionante disso tudo é que durante essa viagem a maquinaria de replicação iria, em média, cometer um único erro.

                                                                  

                                                                                    REFERÊNCIA

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       1 WATSON, J.D. et al. Biologia molecular do gene. 5.ed. Porto Alegre: Artmed, 2006.

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*Biólogo, especialista em Genética & Evolução pela UFPI.

Professores Fernando Pessoa e Lyndon Johnson - Praia das Laranjeiras (SC)