Eventos Epigenéticos (Parte 3) - Silenciamento Gênico por RNAi - Lyndon Johnson Batista de Souza*

A maior parte do Genoma Humano é composto por sequências de DNA que não sofrem transcrição e nem codificam proteínas, no entanto, esse DNA desempenha importantes papéis na célula.

Apenas 1,5% do genoma humano é transcrito em éxons que dá origem as proteínas. Um pequeno montante (0,5%), é transcrito em uma variedade de pequenos tipos de RNA que não codificam proteínas, como RNAr, RNAt, RNAi (RNAsi e RNAmi). Os outros 98% constituem-se de íntrons e sequências regulatórias (24%), sequências não codificantes únicas (15% - fragmentos de genes e pseudogenes), DNA repetitivo não relacionado com os elementos de transposição (15%) e DNA repetitivo que inclui os elementos de transposição (44%). Mas o que vem a ser o RNAi?

Pesquisadores trabalhando com plantas transgênicas tentavam produzir petúnias com uma pigmentação violeta mais intensa, inserindo como um transgene uma cópia extra do gene que produz a enzima responsável pelo pigmento floral. Contrariamente ao esperado, em vez de roxas, as flores nasciam brancas. Ou seja, a cópia extra do gene para pigmentação não apenas não resultava em intensificação da cor como suprimia, inclusive, a ação do gene endógeno, fenômeno conhecido como “co-supressão”. Mais tarde, os pesquisadores entenderam o mecanismo subjacente: o transgene tinha gerado na planta, intermediários de RNA dupla-fita que reconheceram o RNAm homólogo (endógeno), gerando sua degradação.¹ Mas como isso é possível?

Foram descobertos dois tipos de RNAs de fita simples – MicroRNA (RNAmi) & short interfering RNA (RNAsi) – que por bloquearem a tradução, acabam silenciando determinados genes. Por tal motivo, estes RNAs são conhecidos como RNAs de interferência (RNAi). A importância desses tipos de RNA foi reconhecida ao receber o enfoque do Prêmio Nobel em Fisiologia e Medicina de 2006.

^{Transcrito primário do RNAmi}

Os RNAmi são produtos da transcrição de genes presentes em muitos eucariotos. Eles se originam de longos RNAs precursores que se dobram sobre si mesmo, formando várias estruturas curtas, de dupla-fita, em forma de grampo de cabelo - short hairpin RNA (shRNA) - unidas por pontes de hidrogênio. Uma enzima chamada RNAse III (Drosha) vai soltando esses grampos ainda no núcleo, e que aos poucos, vão sendo transportados para o citoplasma. No citoplasma, o pré-RNAmi é processado por outra RNAse III (Dicer) que poda suas extremidades, gerando agora um belo RNAmi de fita dupla. Este produto é incorporado a um complexo chamado RISC (RNA-induced silence complex), que inclui as enzimas Argonautas como principais componentes. Apenas uma das fitas do duplex de RNAmi permanece no complexo RISC para controlar a expressão pós-transcricional de genes-alvo. Se a sequência das bases do RNAmi forem totalmente complementares a um  RNAm  do citoplasma em que se encontra, esse RNAm será degradado pela ação das enzimas Argonautas que integram o complexo RISC, mas na pior das hipóteses se o emparelhamento for incompleto, a tradução será bloqueada (para isso ocorrer tem que ter no mínimo 6 bases de sequência complementar). Nos dois casos, não haverá tradução para proteína. A expressão alterada de componentes da maquinaria de biogênese do RNAmi como Drosha, Dicer e Argonautas, tem sido associada a diferentes tumores humanos, destacando a importância desta via no funcionamento celular adequado.²                     

Geração e função do RNAmi (segundo Campbell et al.8 ed. Artmed)

         Os RNAsi são similares em tamanho e função aos RNAmi. De fato, sabe-se que a mesma maquinaria celular gera RNAmi e RNAsi e que ambos podem se associar com as mesmas proteínas , produzindo resultados semelhantes. A distinção entre RNAmi e RNAsi é baseada na natureza da molécula precursora. Enquanto o RNAmi é formado  a partir de um único grampo do RNA precursor, o RNAsi forma-se a na maioria das vezes a partir de longas moléculas de dsRNA (double-stranded) - RNA de fita dupla -  derivados de origem exógena (como aquelas provenientes de vírus de RNA). Quando tal RNA fita dupla adentra ao citoplasma, a enzima Dicer cliva-o em pequenos fragmentos produzindo assim os RNAsi que irão se associar à proteínas para formar o complexo RISC. Quando o RNAsi está combinado ao RISC, ele é desnaturado de forma dependente de ATP, com isso forma-se um RNA de fita simples que ativa o RISC (indicado na figura por um asterisco). Uma vez ativado, o complexo é dirigido contra um RNAm que contenha uma sequência complementar à de RNAsi. Após o pareamento do RNAsi ao RNAm alvo, a enzima Argonauta (componente catalítico do complexo RISC) cliva o referido RNAm, degradando-o ou inibindo a sua tradução.³

O RISC também pode ser encaminhado para o interior do núcleo pelo RNAsi, e associar-se a regiões do genoma que são complementares ao RNAsi. No núcleo, o complexo recruta outras proteínas que modifica a cromatina em torno do promotor do gene. Essa modificação resulta no silenciamento da transcrição. Um bom exemplo disso ocorre durante a formação do centrômero. Foi comprovado que em leveduras, pequenas regiões do centrômero são transcritas produzindo RNAs que se dobram para formar hastes-alças, ou que se hibridizam a outros RNAs da mesma região. Os dsRNA resultantes são reconhecidos pela Dicer e clivados, originando os RNAsi responsáveis pelo encaminhamento da maquinaria de RNAi de volta para os centrômeros. Reparem que estes RNAsi foram produzidos pelas próprias células do organismo e que não atuaram no bloqueio da tradução, mas sim, na remodelação da cromatina formando heterocromatina altamente condensada na região do centrômero.⁴   
        O silenciamento gênico consiste em desligar um gene por um mecanismo de modificação genética. Tal modificação pode ocorrer durante os eventos transcricionais ou pós-transcricionais. O silenciamento gênico por meio de RNAi tem a vantagem de ser de fácil manipulação e de baixo custo, além disso, por possuírem sequências pequenas e agirem sem a necessidade de pareamento completo, um único RNAi pode regular muitos RNAm-alvo. Outra importante característica do silenciamento gênico por RNAi é a sua extrema eficiência. Quantidades muito pequenas de dsRNA são suficientes para induzir o desligamento completo dos genes-alvo. Embora o motivo para um efeito tão forte continue sem esclarecimento, ele parece envolver uma RNA-polimerase dependente de RNA, necessária em muitos casos de RNAi. O envolvimento dessa enzima sugere que algum aspecto do “sinal” inibidor poderia ser amplificado como parte do processo. Um modo pelo qual isso poderia ser atingido é revelado pela seguinte observação. Quando um dado RNAsi é direcionado contra uma região de um determinado RNAm, frequentemente, são gerados RNAsi adicionais direcionados contra regiões adjacentes do mesmo RNAm. A RNA-polimerase dependente de RNA poderia ter um papel na geração desses RNAsi adicionais, após ter sido recrutada para o RNAm pelo RNAsi original.⁴

O RNAsi desliga a expressão de um determinado gene quando moléculas de dsRNA, homólogas a este gene, são introduzidas ou produzidas nessa célula.(Segundo Watson et al. Biologia molecular do gene. 5 ed. Porto Alegre: Artmed, 2006).

A interferência mediada por RNA é um fenômeno que naturalmente ocorre nos organismos eucariotos (não ocorre em procariontes) e pode ter evoluído originalmente para proteger as células de elementos infecciosos ou desestabilizadores de qualquer tipo, que empreguem um dsRNA intermediário em seu ciclo de replicação. Isso incluiria determinados vírus e diversos transposons que se replicam através de um dsRNA intermediário. O RNAi desliga os genes expressos por esses agentes, bem como destrói os próprios dsRNA intermediários. A importância dessa função do RNAi continua evidente nas plantas. Muitos vírus de plantas desenvolveram mecanismos para contra-atacar a resposta defensiva montada pelo hospedeiro contra o RNAi. Essas funções virais, chamadas supressores virais do silenciamento gênico (VSGS, viral suppressors of gene silencing), normalmente, são determinantes essenciais de virulência, mas são dispensáveis quando as plantas infectadas são deficientes em etapas das vias de RNAi. Também foi relatado que alguns mutantes do verme Caenorhabditis elegans que afetam o RNAi apresentam uma atividade endógena de transposons aumentada.⁵ 

Como método experimental, o RNAi tem tido um impacto rápido e de grande amplitude. Ele permite ao pesquisador silenciar um determinado gene em qualquer organismo, simplesmente pela introdução de moléculas curtas de dsRNA com a sequência complementar à daquele gene no organismo em questão. Torna-se evidente que os RNAi possam alterar a progressão de diversas patologias. Em células de mamíferos, não se pode utilizar esse sistema de silenciamento com dsRNA longos, pois moléculas de RNA dupla-fita com mais de 30 pares de base ativam vias relacionadas com a produção de interferons e a proteína quinase dependente de dsRNA (PKR), levando à apoptose.¹ A eficácia com que o RNAi elimina a expressão dos genes-alvo é crítica, como também a relativa facilidade do procedimento. Dessa forma, para a inativação de um gene, é muito mais fácil utilizar esse método do que a interrupção da sequência codificante do genoma, uma operação que, mesmo quando possível, é muito trabalhosa.⁴  

Algumas aplicações do RNAi:

• Regulação do desenvolvimento;

• Proteção contra infecções por certos vírus;

• Proteção contra os elementos de transposição;

• Terapia gênica por meio do silenciamento de genes específicos;

• Formação de heterocromatina na região dos centrômeros;

• Knockdown gênico: diminuição na quantidade de um RNAm indesejável;

• Genética reversa (estratégia para se conhecer a função de um determinado gene);

• Ação terapêutica contra microorganismos;

• Terapia contra doenças genéticas para as quais não existem drogas efetivas;

• Silenciamento de genes envolvidos no processo de tumorigênese. 

REFERÊNCIAS

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1 BARBOSA, A. S. & LIN, C. J. Silenciamento de Genes Com RNA Interferência: Um Novo Instrumento Para Investigação da Fisiologia e Fisiopatologia do Córtex Adrenal. São Paulo: Universidade de São Paulo, 2004.

2 CAMPBELL, N.A. et al. Biologia. 8. ed. São Porto Alegre: Artmed, 2010.

3 FIRE, A. et al. Potent and specific genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature; 391(6669):806-11, 1998.

4 WATSON, J. D. et al. Biologia molecular do gene. 5.ed. Porto Alegre: Artmed, 2006.

5 FILHO, J. C. M. R. & KIMURA, E. T. MicroRNAs: Nova Classe de Reguladores Gênicos Envolvidos na Função Endócrina e Câncer. São Paulo: Universidade de São Paulo, 2006.

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*Biólogo, especialista em Genética & Evolução pela UFPI.